LS005280ollagenase V膠原酶V型 說明書

膠原酶（Collagenase）是一種蛋白酶，一種肽鏈內(nèi)切酶，能夠特異性的識別Pro-X-Gly-Pro序列（該序列高頻率出現(xiàn)在膠原中，很少發(fā)現(xiàn)于其他蛋白中）并切割該序列中性氨基酸（X）和甘氨酸（Gly）之間的肽鍵。許多蛋白酶都能水解單鏈且變性的膠原多肽，但膠原酶是一種可以降解具有三股超螺旋結(jié)構(gòu)的天然膠原纖維的蛋白酶，這種膠原纖維廣泛存在結(jié)締組織內(nèi)。

本品來源于溶組織梭菌（Clostridium histolyticum），是一種酶粗提物，不僅含有膠原酶（更準(zhǔn)確的稱法為梭菌蛋白酶A（clostridiopeptidase A）），能夠降解天然膠原和網(wǎng)狀纖維。還含有其他的一些蛋白酶、多糖酶、脂酶等，分別能夠有效水解結(jié)締組織和上皮組織細胞外基質(zhì)內(nèi)的其他蛋白，多糖和脂質(zhì)，使得本品非常適用于組織消化。

目前商業(yè)化提供的細菌膠原酶主要根據(jù)膠原酶活性的差異，分為四種類型：膠原酶I型，II型，III型和IV型，在應(yīng)用上有所偏向：

1）膠原酶I（Type I Collagenase）：含有比較均勻的各種酶活力（包括膠原酶、酪蛋白酶、梭菌蛋白酶、胰蛋白酶活性）。通常用作上皮細胞、肝、肺、脂肪和腎上腺組織細胞的制備；

2）膠原酶II（Type II Collagenase）：含有更高的梭菌蛋白酶活性，通常用于心臟、骨、肌肉、胸腺和軟骨等組織來源細胞的制備；

3）膠原酶III（Type III Collagenase）：含有較低的蛋白酶活性，常用于乳腺細胞的制備；

4）膠原酶IV（Type IV Collagenase）：含有低胰酶活性，通常用于胰島細胞的制備，或者需要維持受體完整性的細胞制備實驗。

本品為V型膠原酶，≥125 CDU/mg solid（CDU = collagen digestion units），具有更高的膠原酶活性和酪蛋白酶活性，更低的胰酶水平以降低對細胞膜蛋白的損傷，適用于胰腺小島細胞和結(jié)締組織細胞的分離。

酶活力單位定義

      在37℃，pH7.5 的條件下，5 h內(nèi)水解膠原產(chǎn)生相當(dāng)于1 µM L-亮氨酸的酶量定義為1個酶活力單位。

運輸及保存條件

室溫運輸。4℃避光保存，2年有效。儲存液-20℃避光凍存。

使用方法

1. 膠原酶儲存液的配制

向每管100 mg的膠原酶中加入100 µL的含Ca2+、Mg2+的HBSS（Hank’s平衡鹽溶液，含Ca2+、Mg2+），輕輕旋渦震蕩使其充分溶解，制備成1g/mL（即1000×）的儲存液。然后用低蛋白結(jié)合性的0.22 μm的濾膜過濾除菌，分裝成小份量，然后于-20 °C避光凍存。

使用前于冰上解凍，避免反復(fù)凍融。其用于組織和細胞分散的常用濃度為：0.5-2.5 mg/mL，用于軟骨消化的常用濃度為1-2 mg/mL，需要根據(jù)特定的實驗條件或者參考相應(yīng)的文獻資料確定所需的最佳工作濃度。

2．組織的分離

1. 使用無菌手術(shù)刀或剪刀將組織切成3-4 mm大小的組織塊；

2. 利用含Ca2+、Mg2+的HBSS洗滌組織塊數(shù)次；

3. 加入足量的含Ca2+、Mg2+的HBSS，使其浸沒組織塊，并加入膠原酶至需要工作濃度；

4. 于37℃孵育4-18 h。消化時使用水平搖床以及用3 mM的CaCl2補充消化可以提高消化效率。

5. 已分散開的細胞可使用不銹鋼或尼龍網(wǎng)篩篩得，收集備用。未解離的組織另外添加適量的新鮮膠原酶工作液于37℃繼續(xù)孵育；

6. 利用不含膠原酶的HBSS洗滌收集的細胞數(shù)次；

7. 細胞培養(yǎng)液重懸上述細胞，利用自動細胞計數(shù)器或其他方法計算活細胞密度。

8. 于細胞培養(yǎng)皿上利用合適細胞培養(yǎng)基接種細胞。

3． 器官灌注

1. 向37℃預(yù)熱的含Ca2+、Mg2+的HBSS中加入膠原酶，另添加3 mM的CaCl2有助于提高分離效率；

2. 按照已優(yōu)化的速率對相應(yīng)的器官灌注膠原酶工作液；

3. 將上述過程中回收的灌注液流經(jīng)不銹鋼或尼龍網(wǎng)篩，從而將已解離的細胞或小片段組織塊與較大團塊分離開來，未充分解離的組織需利用新鮮膠原酶工作液于37℃進一步孵育；

4. 利用不含膠原酶的HBSS洗滌收集的細胞數(shù)次；

5. 細胞培養(yǎng)液重懸上述細胞，利用自動細胞計數(shù)器或其他方法計算活細胞密度。

6. 于細胞培養(yǎng)皿上利用合適細胞培養(yǎng)基接種細胞。

注意事項

    1. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

    2. 本產(chǎn)品主要用于科研領(lǐng)域，不宜用于臨床診斷或其他用途。